專家點(diǎn)評：厭氧氨氧化菌的富集培養(yǎng)是限制該工藝的關(guān)鍵因素，文章通過對照試驗(yàn)考察了鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)的影響，并采用定量PCR及16S rRNA高通量測序技術(shù)分析其機(jī)理，研究結(jié)果對厭氧氨氧化污泥的富集培養(yǎng)及工藝的啟動具有參考價值和指導(dǎo)意義。該文試驗(yàn)數(shù)據(jù)充分，理論分析合理，撰寫規(guī)范，較好地表達(dá)了研究過程和結(jié)果，研究成果具有理論意義和實(shí)用價值。

本研究通過對照試驗(yàn)考察了鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)的影響，并采用熒光定量PCR及16S rRNA高通量測序技術(shù)從微生物生態(tài)學(xué)解析其機(jī)理，研究結(jié)果對厭氧氨氧化污泥的富集培養(yǎng)及工藝啟動具有參考價值和指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)裝置與運(yùn)行條件

試驗(yàn)采用小試規(guī)模厭氧顆粒污泥膨脹床反應(yīng)器(expanded granular sludge bed, EGSB)，由有機(jī)玻璃制作，有效容積為0.8 L，外覆錫紙以隔絕光的影響。反應(yīng)器運(yùn)行溫度通過恒溫循環(huán)水槽維持在35 ℃，進(jìn)水pH值用0.1 mmol/L鹽酸調(diào)節(jié)為6.6~6.8，以保證Fe(Ⅲ)的溶解;本試驗(yàn)采用連續(xù)流，水力停留時間(HRT)為24 h，試驗(yàn)裝置如圖1所示。

1.2接種污泥與模擬廢水

試驗(yàn)所用接種污泥取自南京某市政污水廠氧化溝缺氧段，為棕黃色絮狀污泥。反應(yīng)器接種污泥量為20 g/L，接種前用pH值= 7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗三次，以洗去殘余物質(zhì)。模擬廢水以自來水配置，組分為：(NH4)2SO4 (按需配制)、NaNO2 (按需配制)、KH2PO410 mg/L、CaCl2˙2H2O 5.6 mg/L、MgSO4˙7H2O 300 mg/L、KHCO3 500 mg/L、EDTA 25 mg/L、微量元素濃縮液Ⅰ 1.25 mL/L、微量元素濃縮液Ⅱ (按需配制)。微量元素濃縮液Ⅰ組分為：FeSO4 0.625 mL/L、H3BO4 0.0175 mL/L、MnCl2˙4H2O1.2375 mL/L、CuSO4˙5H2O 0.3125 mL/L、ZnSO4˙7H2O 0.5375 mL/L、NiCl2˙6H2O 0.2375 mL/L、NaSeO4˙10H2O 0.2625 mL/L、NaMoO4˙2H2O 0.275 mL/L。微量元素濃縮液Ⅱ：FeCl3 (按需配制)，R1為控制組，模擬廢水中不添加微量元素濃度液Ⅱ;而試驗(yàn)組R2、R3中添加微量元素濃縮液Ⅱ并控制Fe(Ⅲ)濃度分別為0.04、0.08 mmol/L。模擬廢水預(yù)曝高純氮?dú)?> 99.5%)至溶解氧濃度(DO)低于0.5 mg/L，再泵入反應(yīng)器中。

1.3常規(guī)指標(biāo)分析方法

反應(yīng)器出水定期采樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后測定，分析測定方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)。NH4+-N采用水楊酸分光光度法;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N采用酚二磺酸分光光度法;Fe(Ⅲ)采用鄰菲啰啉光光度法;溶解氧(DO)以便攜式溶解氧儀測定，pH值由pH計測定。

1.4污泥粒徑分析

從反應(yīng)器中取一定量污泥至50 mL離心管中，置于激光粒度儀(Mastersizer 3000，英國馬爾文儀器有限公司)中檢測。樣品充分混勻后，以水為分散劑進(jìn)行分析測試，并使用機(jī)器配置的軟件進(jìn)行記錄，使用一次性塑料滴灌吸取攪拌均勻的樣品，污泥樣加至遮光度在10%~15%時進(jìn)行測試。單一樣品重復(fù)測定三次，以降低誤差。

1.5實(shí)時熒光定量PCR分析

污泥樣品采用FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒提取污泥DNA，而后用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計定量，采用SYBR® Green染料法進(jìn)行定量PCR分析。選取目標(biāo)基因包括：細(xì)菌16S rRNA基因、厭氧氨氧化菌16S rRNA基因及部分氮素轉(zhuǎn)化功能基因，以含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2 > 0.999)。擴(kuò)增體系為25 μL，含12.5 μL 2 × SYBR® Green PCR Master Mix(Vazyme，中國)，2 μL模板DNA(20 ng/μL)，正反引物各0.2 μL，10.1 μL無菌超純水;擴(kuò)增程序在熒光定量PCR儀AB7500(Life Technologies, 美國)進(jìn)行，每個樣品做三個平行，具體參數(shù)如表1所示。

表1 目標(biāo)基因的引物序列及退火溫度

1.616S rRNA高通量測序分析

16S rRNA高通量測序分析基于Illumina Miseq測序平臺，具體步驟包括DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物驗(yàn)證及純化、測序及結(jié)果分析。DNA提取見1.5，PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物，引物序列為：正向引物(5’-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)，反向引物(5’-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’);擴(kuò)增體系為50 μL，含5 μL 10×PCR Buffer (TaKaRa，日本)、0.25 μL Ex Taq DNA聚合酶、4 μL MgCl2、4 μL DNTP Mixture、2 μL DNA模板(20 ng/μL)、正反引物各1 μL，無菌超純水若干。擴(kuò)增反應(yīng)于Veriti PCR儀(Life Technologies，美國)進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性98 ℃/5 min，擴(kuò)增循環(huán)20次(變性98 ℃/30 s，退火50 ℃/30 s，延伸72 ℃/40 s)，延伸72 ℃/10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，經(jīng)E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit試劑盒純化后，送至江蘇中宜金大分析檢測有限公司進(jìn)行測序分析。測序數(shù)據(jù)使用Sickle和Mothur程序降噪處理，而后用RDP classifier對序列分類，使用Heml程序繪制熱圖。

2結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)器運(yùn)行性

能厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)過程中，為考察鐵離子的影響，反應(yīng)器保持同步容積氮負(fù)荷提升，直至運(yùn)行穩(wěn)定。反應(yīng)器R1、R2、R3進(jìn)出水氮素指標(biāo)、容積氮負(fù)荷及氮去除速率如圖2所示。

圖2 鐵離子對厭氧氨氧化污泥富集培養(yǎng)過程中脫氮效能的影響

由圖2可知，富集培養(yǎng)初期(0~4 d)各反應(yīng)器均出現(xiàn)菌體自溶現(xiàn)象，表現(xiàn)為出水NH4+-N濃度高于進(jìn)水。由于進(jìn)水中無有機(jī)碳源，且溶解氧濃度嚴(yán)格限制，導(dǎo)致部分微生物難以適應(yīng)無機(jī)環(huán)境而自溶。在菌體自溶階段，反應(yīng)器中存在強(qiáng)烈的內(nèi)源反硝化作用，出水NO2--N及NO3--N濃度幾乎為0;此時反應(yīng)器污泥顏色由黃棕變黑，并伴有明顯的減量。

隨著菌體自溶作用的減弱，反應(yīng)器進(jìn)入活性遲滯階段，表現(xiàn)出微弱的厭氧氨氧化作用。在此階段(5~38 d)，進(jìn)水NH4+-N和NO2--N保持在45.1 mg/L和61.1 mg/L，各反應(yīng)器運(yùn)行并未表現(xiàn)出明顯差異。各反應(yīng)器中出水NH4+-N濃度為24.6~42.6 mg/L，平均NH4+-N去除率為21.8%~26.7%，反應(yīng)器出水NO2--N濃度較低，表明反應(yīng)器中仍存在一定的反硝化作用。在此階段，各反應(yīng)器逐漸適應(yīng)環(huán)境，反硝化作用減弱，出水水質(zhì)變化特征類似。

隨著反硝化功能的減弱，各反應(yīng)器中厭氧氨氧化作用不斷增強(qiáng)，成為主要脫氮途徑，為活性提高階段。在此過程，各反應(yīng)器進(jìn)水容積氮負(fù)荷同步提升，由于鐵離子的添加，反應(yīng)器表現(xiàn)出不同的容積氮負(fù)荷耐受能力。反應(yīng)器R1活性提高階段為39~88 d，容積氮負(fù)荷由132.6 mg/(L˙d)提升至489.4 mg/(L˙d);R2在活性提高階段(39~100 d)容積氮負(fù)荷由132.6 mg/(L˙d)提升至580.9 mg/(L˙d);R3活性提高階段為39~112 d，容積氮負(fù)荷由132.6 mg/(L˙d)提升至696.6 mg/(L˙d)。容積氮負(fù)荷提升量由高到低為R3 > R2 > R1;此外，活性提高階段R1、R2、R3中平均總氮去除率分別為82.9%、84.2%、85.3%，試驗(yàn)組R2、R3整體脫氮效率略高于R1。

在厭氧氨養(yǎng)護(hù)污泥富集培養(yǎng)中，由于厭氧氨氧化菌生長緩慢，反應(yīng)器容積負(fù)荷有限。許多研究證明了高氮素基質(zhì)對厭氧氨氧化菌的抑制作用。Strous等研究表明亞硝酸鹽濃度達(dá)到100 mg/L，即可強(qiáng)烈抑制厭氧氨氧化菌活性;本研究以出水亞硝酸鹽濃度高于100 mg/L作為反應(yīng)器超過可承受負(fù)荷并失穩(wěn)的依據(jù)。對照組R1在運(yùn)行90 d時，容積氮負(fù)荷超出反應(yīng)器承受極限，出水NH4+-N和NO2--N濃度急劇升高，類似失穩(wěn)現(xiàn)象也出現(xiàn)在試驗(yàn)組R2(第102 d)、R3(第114 d)。反應(yīng)器失穩(wěn)后，降低進(jìn)水基質(zhì)氮濃度，同時加大回流比以解除基質(zhì)自抑制;由于EGSB反應(yīng)器抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)，反應(yīng)器很快恢復(fù)穩(wěn)定運(yùn)行。穩(wěn)定階段反應(yīng)器運(yùn)行狀況如表2所示。Chen等通過批次試驗(yàn)證明了3.68 mg/L的鐵離子添加下，比厭氧氨氧化活性可提高533.2%;長期試驗(yàn)證明，鐵離子的添加，相較于控制組，提升了19.5%的反應(yīng)器容積負(fù)荷，與本研究結(jié)果類似。

表2 穩(wěn)定階段反應(yīng)器運(yùn)行狀況

2.2污泥粒徑分布

本研究采用EGSB反應(yīng)器培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥，接種污泥為絮狀反硝化污泥，取接種污泥及130 d污泥樣品，用激光粒度儀分析其粒徑，結(jié)果如圖3所示。

富集培養(yǎng)130 d時，表觀觀察發(fā)現(xiàn)污泥呈顆?；卣鳌＜す饬６确治鼋Y(jié)果顯示，反應(yīng)器R1、R2、R3中污泥樣品平均粒徑分別為796、908 μm和1040 μm，試驗(yàn)組R2、R3中污泥粒徑較高。據(jù)DLVO理論，當(dāng)負(fù)載電性相同的電荷時，由于細(xì)菌個體之間靜電斥力的存在，不利于顆粒狀富集培養(yǎng)物的形成。添加多價陽離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+等)，可以減少細(xì)菌間的靜電斥力，通過壓縮雙電層促進(jìn)細(xì)胞聚集，進(jìn)而強(qiáng)化顆粒污泥富集。本試驗(yàn)中，鐵離子的添加強(qiáng)化了厭氧氨氧化污泥的顆?；?除減少細(xì)菌間靜電斥力作用外，鐵離子還是酶的常見活性劑，提高微生物代謝活性，促進(jìn)微生物生長，加速厭氧氨氧化污泥的顆?；?。

2.3功能基因及厭氧氨氧化菌豐度變化

定量PCR結(jié)果顯示(圖4)，經(jīng)過130 d的富集培養(yǎng)，各反應(yīng)器微生物的量明顯提升，細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)由初始的1.04×107copies/ng DNA 分別提高到1.34×107 copies/ng DNA (對照組R1)、2.73×107 copies/ng DNA(試驗(yàn)組R2)和3.63×107copies/ng DNA (試驗(yàn)組R3); R2、R3中豐度顯著高于R1 (p < 0.05)。由于進(jìn)水中不含有機(jī)碳源，且嚴(yán)格限氧，反硝化微生物受到抑制，相關(guān)的功能基因napA (編碼周質(zhì)硝酸鹽還原酶)、narG (編碼膜結(jié)合硝酸鹽還原酶)、nirK (編碼銅型亞硝酸還原酶)、nirS (編碼細(xì)胞色素cd1型亞硝酸還原酶)的豐度顯著降低。接種污泥中基因narG、napA、nirS、nirK豐度分別為1.01×106、3.16×105、4.71×106、1.01×107 copies/ng DNA，經(jīng)過130 d的富集培養(yǎng)，其在反應(yīng)器中豐度分別降至6.86×103 ~ 8.65×103、1.96×104 ~ 4.24×104、1.47×104 ~ 6.01×104、2.70×104 ~ 5.35×104copies/ng DNA，反應(yīng)器R1、R2、R3間無顯著差異。此外，接種污泥中氨單加氧酶編碼基因amoA豐度為5.05×103 copies/ng DNA，富集培養(yǎng)130天后，反應(yīng)器中amoA基因拷貝數(shù)為2.49 ~ 2.90×102 copies/ng DNA。

隨著污泥的富集培養(yǎng)，厭氧氨氧化成為反應(yīng)器主要的脫氮途徑，相應(yīng)的，厭氧氨氧化菌16S rRNA和功能基因hzsB豐度顯著增加。富集培養(yǎng)130 d后，R2、R3中Anammox 16S rRNA豐度分別為6.96×106、8.47×106 copies/ng DNA，顯著高于對照組R1中豐度(p < 0.05)。

聯(lián)氨合成酶為厭氧氨氧化菌的重要功能蛋白，其編碼基因hzsB豐度經(jīng)富集培養(yǎng)過程也明顯提高;130 d時，對照組R1中hzsB豐度為6.83×106 copies/ng DNA，而試驗(yàn)組R2、R3中其豐度分別為9.86×106、1.24×106 copies/ng DNA，顯著高于對照組R1(p < 0.05)?？梢酝茰y，鐵離子對厭氧氨氧化菌富集具有一定促進(jìn)作用，同時提高了厭氧氨氧化活性，也與反應(yīng)器脫氮效能結(jié)果一致。

2.4微生物群落結(jié)構(gòu)變化

接種污泥及富集培養(yǎng)130 d后各反應(yīng)器污泥微生物群落結(jié)構(gòu)如圖5所示。接種污泥為反硝化污泥，由圖5(a)可見變形菌(Proteobacteria)和綠彎菌(Chloroflexi)為其優(yōu)勢菌門，分別占比44.08%和19.11%;富集培養(yǎng)過程中微生物菌群結(jié)構(gòu)顯著改變，Proteobacteria菌豐度分別降至31.72% (R1)、30.74% (R2)、30.52% (R3)。綠彎菌(Chloroflexi)相對豐度無明顯變化，而厭氧氨氧化菌所屬浮霉菌(Planctomycetes)豐度明顯提高，由接種污泥中的0.20%提高至5.10% (R1)、7.31% (R2)、9.54% (R3)，試驗(yàn)組中富集程度較高。

圖5(b)為污泥微生物屬水平熱圖?？梢钥闯?，厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia明顯富集;接種污泥中Candidate Brocadia菌難以檢測其豐度(< 0.01%)，經(jīng)130 d的富集培養(yǎng)，對照組R1污泥樣品中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為4.2%，而試驗(yàn)組R2、R3污泥樣品中其豐度分別為6.8%、8.2%，高于對照組R1。

3結(jié)論

(1)進(jìn)水添加鐵離子富集培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥過程中，試驗(yàn)組R2、R3與對照組R1中呈現(xiàn)類似的規(guī)律性，而試驗(yàn)組可承受容積氮負(fù)荷顯著高于對照組。穩(wěn)定階段，試驗(yàn)組R2、R3容積氮去除速率分別為495.6、602.4 mg-N/(L˙d)，為對照組R1的1.20和1.46倍。進(jìn)水添加鐵離子提高了反應(yīng)器容積氮負(fù)荷及運(yùn)行效能。

(2)進(jìn)水添加鐵離子富集培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥130 d后，污泥群落結(jié)構(gòu)及功能基因豐度顯著變化。反硝化功能基因narG、napA、nirS、nirK豐度顯著降低，厭氧氨氧化菌及微生物量富集明顯。試驗(yàn)組R2、R3中厭氧氨氧化菌Candidate Brocadia相對豐度為6.8%、8.2%，明顯高于對照組R1(4.2%)。

來源:凈水技術(shù)  作者:毛念佳等 

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